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总胆固醇检测试剂盒(COD-PAP双试剂比色法)用于人或动物的血清、血浆、脑脊液、细胞、组织等样本中的总胆固醇含量定量测定。

血液中的胆固醇约1/3为游离胆固醇，2/3为与脂肪酸结合的胆固醇酯，后者被胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇，游离胆固醇被胆固醇氧化酶(COD)氧化成胆甾烯酮，并产生过氧化氢，再经过氧化物酶(POD)催化，使4-氨基安替比林与酚(三者合称PAP)反应，生成红色醌亚胺色素(Trinder反应)，分光光度计在500～520nm处进行比色测定，用于人或动物的血清、血浆、脑脊液、细胞、组织等样本中的总胆固醇含量定量测定。

• 生理盐水或PBS
  
• 离心管、小试管或96孔板、水浴锅或恒温箱、分光光度计或酶标仪、全自动或半自动生化分析仪

• 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
  
• COD-PAP工作液如不经常使用，应充分溶解后分装-20℃保存，可4℃短期保存。
  
• 本法可直接用于检测脑脊液中的TC含量，但不能直接检测尿液中的TC含量，因为未经处理的尿液中含有还原性物质，影响过氧化物酶反应。
  
• 检测TC的血清或血浆宜用EDTA或肝素抗凝，如不能及时测定，密闭保存，4℃可稳定1周，-20℃可以稳定半年以上。
  
• 本法线性范围可达13mmol/L，如果样本TC浓度过高，结果可能呈假性降低，应用生理盐水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。
  
• 本试剂盒既可作终点法检测，又可作速率法检测。
  
• 本法不适于检测游离胆固醇的浓度。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。
  
• 本试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

• 样本处理：
  
  • 血清、血浆、脑脊液样本：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水稀释后检测。
    
  • 细胞样本：
    
    • 取适量的细胞(一般推荐＞10⁶)，1000g离心10min，弃上清，留取沉淀。
      
    • 用PBS或生理盐水清洗1～2次，1000g离心10min，弃上清，留取沉淀。
      
    • 加入200～300μL的PBS或生理盐水匀浆，冰浴条件下超声破碎细胞，功率300W，每次3~5s，间隔30s，重复3～5次，亦可手动匀浆，制备好的匀浆液不可离心；亦可用1～2% Triton X-100冰浴30～60min，制备好的裂解液不可离心。
  • 组织样本：准确称取适量组织样本，按质量(g)∶生理盐水或PBS(ml)＝1∶9的比例，加入生理盐水或PBS，冰浴条件下手动或机械匀浆，2500～3000g离心10min，取上清。
• TC测定
  
  • 各种仪器按上表依次加入试剂，充分混匀，37℃水浴中孵育5min。
    
    • 酶标仪、全自动生化分析仪TC测定：
      

      加入物(μL)	空白孔	标准孔	待测孔
      ddH2O	3	-	-
      TC标准(5mmol/L)	-	3	-
      待测样本	-	-	3
      COD-PAP工作液	300	300	300

    • 分光光度计(1mL比色杯)、半自动生化分析仪TC测定：
      

      加入物(mL)	空白管	标准管	待测管
      ddH2O	0.01	-	-
      TC标准(5mmol/L)	-	0.01	-
      待测样本	-	-	0.01
      COD-PAP工作液	1	1	1

    • 普通分光光度计(2mL比色杯)TC测定：
      

      加入物(mL)	空白管	标准管	待测管
      ddH2O	0.02	-	-
      TC标准(5mmol/L)	-	0.02	-
      待测样本	-	-	0.02
      COD-PAP工作液	2	2	2

  • 立即用相应仪器测定500～520nm吸光度，以空白孔(管)调零，读取标准孔(管)、测定孔(管)的吸光度，分别记为A _标准、A _测定。
    机器参数：
    

    主波长/次波长	500/600nm
    反应类型	终点法
    反应方向	升反应(+)

• 血清、血浆等液体样本(空白调零)：
  FC(mmol/L)＝ A _测定/A _标准×5
  
• 血清、血浆等液体样本(全自动生化分析仪)：
  FC(mmol/L)＝ (A _测定－A _空白)/(A _标准－A _空白)×5
  
• 组织样本(空白调零)：
  FC(mmol/g)＝ A _测定/A _标准×5×V₂/(m×1000)
  
• 组织样本(全自动生化分析仪)：
  FC(mmol/g)＝ (A _测定－ A _空白)/(A _标准－A _空白)×5×V/(m×1000)
  
• 细胞样本(空白调零)：
  FC(mmol/L)＝ A _测定/A _标准×5×V₂/V₁
  
• 细胞样本(全自动生化分析仪)：
  FC(mmol/L)＝(A _测定－A _空白)/(A _标准－ A _空白)×5×V₂/V₁